對胃粘膜損傷有輔助保護功能評價方法

試驗項目、試驗原則及結果判定

Items, Principles
and Result Assessment

1
試驗項目

1.1 動物實驗

1.1.1
體重  

1.1.2
胃粘膜大體損傷狀況

1.1.3
胃粘膜病理損傷積分

1.2 人體試食試驗

1.2.1
臨床癥狀

1.2.2
體征

1.2.3胃鏡觀察

2
試驗原則

2.1 動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。

2.2 無水乙醇、消炎痛致急性胃粘膜損傷模型或冰醋酸致慢性胃粘膜損傷模型任選其一進行動物實驗。

2.3 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的安全性作進一步的觀察。

3
結果判定

3.1 動物實驗：實驗組與模型對照組比較，大體觀察評分與病理組織學檢查評分結果均表明胃粘膜損傷明顯改善，可判定該受試樣品動物實驗結果為陽性。

3.2 人體試食試驗：試食組與對照組比較，臨床癥狀、體征積分明顯減少，胃鏡復查結果有改善，可判定該受試樣品對胃粘膜有輔助保護功能。

對胃粘膜損傷有輔助保護功能檢驗方法

Method for the Assessment of
Protection

of Gastric Mucosa Function

1
動物實驗

1.1
原理

在一定時間內給予一定量的受試樣品，用對胃粘膜有損傷作用的物質造成急性胃粘膜損傷模型，觀察各劑量組胃粘膜的損傷程度；或用對胃粘膜有損傷作用的物質造成慢性胃潰瘍模型，在一定時間內給予一定量的受試樣品，觀察各劑量組胃潰瘍的面積和體積，反映受試樣品對胃粘膜的保護作用。

1.2
實驗動物

選用SD或Wistar 健康大鼠，單一性別，180－220克，每組8－12只。

1.3
實驗設計及劑量分組

受試物設三個劑量組，其中一個應為人體推薦量的5倍劑量組，并同時設置正常對照組。不同的損傷模型，還應設置相應的模型對照組。慢性潰瘍模型應先造模，手術次日再分組。受試樣品給予時間一般為14—30天，必要時可以延長至45天。

1.4
胃粘膜損傷模型

1.4.1 急性胃粘膜損傷酒精模型

1.4.1.1
實驗動物：選用Wistar或SD健康大鼠，單一性別。

1.4.1.2
實驗器材及試劑：解剖器械，游標卡尺，酒精或醋酸，病理制片系統，生物顯微鏡等。

1.4.1.3
實驗方法：動物隨機分正常對照組、模型組和受試樣品三個劑量組。各劑量組灌胃樣品30天后，全部動物嚴格禁食24小時（不禁水），此期間亦禁止給予受試物。除空白對照外，所有試驗組動物給予無水乙醇1.0ml/只，1小時后處死動物，暴露完整胃，結扎幽門，灌注適量10%甲醛溶液，固定20min，然后沿胃大彎剪開，洗凈胃內容物，展開胃粘膜，在體視解剖顯微鏡下或肉眼下用游標卡尺測量出血點或出血帶的長度和寬度。因寬度所代表損傷的嚴重性遠較長度大，故雙倍積分。其評分標準見表1。

表1  急性酒精損傷肉眼觀查評分標準

觀察指標：各實驗組胃粘膜損傷程度以損傷發(fā)生率（%）、損傷積分指數和損傷抑制率表示。損傷發(fā)生率（%）= 某組出現出血或潰瘍的大鼠數量／該組大鼠數量×100%；損傷積分指數 = 組損傷評分總和／組動物數量；損傷抑制率（%）= (A-B) /A′100%（A、B分別為模型組與試驗組的損傷積分）。

病理組織學觀察及評分：大體檢查完畢，將每只動物胃粘膜損傷最嚴重的部位切下，固定于10%甲醛溶液，常規(guī)制片，HE染色，鏡下觀察。注意選擇胃粘膜正橫切面，包括粘膜全層的區(qū)域觀察。評分方法：以充血、出血、粘膜細胞變性壞死在整個粘膜上皮層的累及程度分為5級。充血權重為1，出血權重為2，上皮細胞變性壞死權重為3，評分標準及病變總積分公式見表2。

表2  急性胃粘膜損傷鏡下評分標準

1.4.2急性胃粘膜損傷消炎痛模型

1.4.2.1
實驗動物：選用Wistar或SD健康大鼠，單一性別。

1.4.2.2
實驗器材及試劑：解剖器械或游標卡尺，病理制片系統；消炎痛，甲醛等。

1.4.2.3
實驗方法：動物隨機分正常對照組、模型組和受試樣品三個劑量組，灌胃給予動物受試物30天后，禁食不禁水24小時，模型組和劑量組給予消炎痛40mg/kg一次性腹腔注射。5小時后處死動物，剖腹將胃取出，結扎幽門和賁門，從十二指腸與幽門部結合處注入10%甲醛溶液5 ml，固定20分鐘后，沿胃大彎剪開，洗凈胃內容物，展開胃粘膜，用紙吸干，觀察胃粘膜損傷程度。用游標卡尺測量胃出血或潰瘍的最大長度及寬度，以出血或潰瘍的最大長寬徑作為損傷指標評分。消炎痛所致胃粘膜損傷的潰瘍一般較小，肉眼觀查以點狀多見，其評分標準見表3。

表3  急性胃粘膜損傷消炎痛模型評分標準

 
 
 
 
 


 
 
 
 
 


 
 
 
 
 


 
 
 
 
 


 

損傷形態(tài)	1分	2分	3分	4分
出血點	1個	-	-
出血帶長度	1-2mm	2-4mm	4-6mm	>6mm
出血帶寬度	1-2mm	>2mm
總積分 = 出血點分值+長度分值+（寬度分值′2）

注：長度和寬度均以最大徑計。

觀察指標：各實驗組胃粘膜損傷程度以損傷發(fā)生率（%）、損傷指數和損傷抑制率表示。損傷發(fā)生率（%）= 某組出現出血或潰瘍的大鼠數量／該組大鼠數量×100%；損傷指數 = 組損傷評分總和／組動物數量；損傷抑制率（%）=(A-B)/A′100%（A、B分別為模型組與試驗組的損傷積分）

病理組織學觀察及評分：同急性胃粘膜損傷酒精模型。

1.4.3 慢性胃潰瘍模型

1.4.3.1
動物：選用Wistar或SD健康大鼠，單一性別。

1.4.3.2
實驗器材及試劑：帶標尺的解剖鏡、微量注射器，醋酸、半胱氨酸等

1.4.3.3
實驗方法：

1.4.3.3.1
醋酸注射法：將動物禁食不禁水24小時，乙醚或1%巴比妥鈉麻醉后實施剖腹手術，消毒腹部，于劍突下切開腹腔，將胃輕拉出腹腔外，用微量注射器于胃幽門處漿膜下注射20-30ml的30%冰醋酸，縫合切口，術后正常喂食和水。第二天將手術后狀態(tài)良好的動物按體重隨機分為模型組和受試樣品三個劑量組。各劑量組按相應劑量灌胃，連續(xù)14天。模型組灌胃蒸餾水或溶劑。禁食24小時后處死，取出整個胃浸泡于10%的甲醛內，浸泡20分鐘后沿胃大彎剪開，洗凈內容物，取腺胃區(qū)展開平鋪于玻璃板上，用紙吸干潰瘍內的水分，測量其面積和體積。

潰瘍面積和體積測量法：于帶標尺的解剖顯微鏡下計數潰瘍所占的方格數，換算成面積。然后用微量注射器將有色墨水注入潰瘍內，將潰瘍填滿與周邊平齊，讀取微量注射器上刻度即為潰瘍的體積。

1.4.3.3.2
冰醋酸浸漬法：將動物禁食不禁水24小時，乙醚或1%巴比妥鈉麻醉后實施剖腹手術，消毒腹部，于劍突下切開腹腔，將內徑5mm、長30mm的玻璃管垂直放置胃體部粘膜上，向管腔加入冰醋酸0.2ml，1.5分鐘后用棉簽蘸出冰醋酸，縫合手術切口，術后正常喂食和水，第二天將手術后狀態(tài)良好的動物按體重隨機分組、給藥，動物處置和測量等操作同上。

1.5
數據處理和結果判定

數據可用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F值< F0.05，結論：各組均數間差異無顯著性。F值≥F0.05，即P≤0.05，用多個實驗組和對照組間均數的兩兩比較方法進行統計。對非正態(tài)或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉換后的數據進行統計。若變量轉換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統計。

受試物一個或一個以上劑量組與模型對照組進行比較，大體觀察評分與病理組織學檢查評分結果均表明胃粘膜損傷明顯改善，可判定該受試樣品動物實驗結果為陽性。

1.6
注意事項

動物禁食應完全，應嚴格控制動物禁食期間食糞便、皮毛、墊料等。

2
人體試食試驗

2.1
受試者的選擇標準

2.1.1
納入受試者標準：符合慢性淺表性胃炎診斷標準且經胃鏡篩選確診為胃粘膜損傷的自愿受試者。

2.1.2
慢性淺表性胃炎診斷標準：病程遷延，有不同程度的消化不良、上腹痛、燒心、噯氣、反酸、腹脹等臨床癥狀，可有上腹部輕度壓痛。符合慢性淺表性胃炎纖維胃鏡診斷標準及活體組織檢查診斷標準。排除胃潰瘍患者。

2.1.3
排除受試者標準：

2.1.3.1
年齡在18歲以下或65歲以上，妊娠或哺乳期婦女，過敏體質及對本樣品過敏者。

2.1.3.2
繼發(fā)性慢性胃炎。

2.1.3.3
合并有心血管、腦血管、肝、腎和造血系統嚴重疾病，精神病患者。

2.1.3.4
經常用藥、嗜酒、吸煙，4周內參加過其它實驗。

2.1.3.5
 3個月內用過已知對胃腸功能有損害的藥物。

2.1.3.6
癥狀、體征分級為重癥者。

2.1.3.7
有嚴重消化系統潰瘍的病人。

2.1.3.8
正在服用其它治療藥物或接受其它治療者。

2.1.3.9
未按規(guī)定服用樣品，無法判斷功效，或資料不全等影響功效或安全性判斷者。

2.2試驗設計及服樣期限

采用組間和自身兩種對照設計。按受試者的癥狀輕重隨機分為試食組和對照組，盡可能考慮影響結果的主要因素如年齡、性別、病程等，進行均衡性檢驗，以保證組間的可比性。每組受試者不少于50例。

2.3
受試樣品的劑量和使用方法

試食組按推薦服用方法、服用量服用受試產品，在試驗期間停用其它用于慢性胃病的物品，對照組服有相同作用的陽性物。按雙盲法進行試食試驗。觀察時間不少于30天，必要時可延長至45天。試驗期間不改變原來的飲食習慣，正常飲食。

2.4
觀察指標

2.4.1 安全性指標

2.4.1.1
一般狀況：包括精神、睡眠、飲食、大小便、血壓等

2.4.1.2
血、尿、便常規(guī)檢查

2.4.1.3
肝、腎功能檢查

2.4.1.4
胸透、心電圖、腹部B超檢查（僅在試驗開始前檢查一次）

2.4.2 功效指標

2.4.2.1
癥狀觀察

胃痛、噯氣、反酸、腹脹、食欲不振、少食等臨床癥狀。體征觀察劍突下壓痛程度。按癥狀輕重統計積分（重癥3分，中度2分，輕度1分），見表4。

表4  人體試食試驗癥狀輕重分級表

 
 
 
 


 
 
 
 


 
 
 
 


 
 
 
 


 
 
 
 


 
 
 
 

癥狀	輕（1分）	中（2分）	重（3分）
胃痛	輕微，持續(xù)時間短，不影響工作及休息	疼痛時間較長，每日超4小時，尚能忍受，但對工作及休息有一定影響	疼痛較重，持續(xù)難忍，需服藥才能減輕
噯氣	偶有發(fā)作	經常發(fā)作，引及兩脅不適	頻繁發(fā)作，引及兩脅疼痛
反酸	偶有吐酸	飲食不適即吐酸	頻繁吐酸
腹脹	腹脹輕微，時作時止，在短時間內可較甚	腹脹較甚或發(fā)作頻繁，在較長時間內不緩解，影響工作及休息	腹脹難忍，持續(xù)時間長，需服藥才能減輕
少食	食欲較差，飯量減少1/2以內	飯量減少1/2－2/3	無食欲，飯量減少2/3以上

2.4.2.2
胃鏡檢查與體征觀察

劍突下壓痛程度檢查，根據疼痛程度分為輕（1分）、中（2分）、重（3分）。

輕度：用力時才出現疼痛，壓痛輕微  1分

中度：用力即出現疼痛，但疼痛尚能忍受，壓痛明顯  2分

重癥：稍微用力即出現疼痛，疼痛不能忍受，壓痛劇烈  3分

隨機選擇試食組和對照組各15例受試者進行胃鏡檢查，比較試食試驗前后的改變。

2.5
 數據處理和結果判定

統計癥狀和體征積分值。

試驗數據為計量資料，可用t檢驗進行分析。凡自身對照資料可以采用配對t檢驗，兩組均數比較采用成組t檢驗，后者需進行方差齊性檢驗，對非正態(tài)分布或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態(tài)方差齊后，用轉換的數據進行t檢驗。若轉換數據仍不能滿足正態(tài)方差齊要求，改用t’檢驗或秩和檢驗，但變異系數太大（如CV>50％）的資料應用秩和檢驗。

結果判定：試食前后試食組自身比較及試食后試食組與對照組組間比較，臨床癥狀、體征積分明顯減少，胃鏡復查結果有改善或不加重，可判定該受試樣品對胃粘膜損傷有輔助保護功能。